Cryo-EM menangkap editor basis CRISPR-Cas9 dalam aksi – Sains Terkini

Hanya dalam delapan tahun, CRISPR-Cas9 telah menjadi editor genom untuk penelitian dasar dan terapi gen. Tetapi CRISPR-Cas9 juga telah menelurkan alat manipulasi DNA berpotensi kuat lainnya yang dapat membantu memperbaiki mutasi genetik yang bertanggung jawab atas penyakit keturunan.

Para peneliti di University of California, Berkeley, sekarang telah memperoleh struktur 3D pertama dari salah satu alat yang paling menjanjikan ini: editor basa, yang mengikat DNA dan, alih-alih memotong, justru mengganti satu nukleotida dengan yang lain.

Pertama kali dibuat empat tahun lalu, editor basis sudah digunakan dalam upaya untuk memperbaiki mutasi nukleotida tunggal dalam genom manusia. Editor basis yang sekarang tersedia dapat menangani sekitar 60% dari semua penyakit genetik yang diketahui – berpotensi lebih dari 15.000 kelainan bawaan – disebabkan oleh mutasi hanya dalam satu nukleotida.

Struktur 3D terperinci, dilaporkan dalam jurnal edisi 31 Juli Ilmu, memberikan peta jalan untuk mengutak-atik basis editor untuk membuatnya lebih fleksibel dan terkontrol untuk digunakan pada pasien.

"Kami dapat mengamati untuk pertama kalinya seorang editor dasar beraksi," kata sesama postdoktoral UC Berkeley, Gavin Knott. "Sekarang kita dapat memahami tidak hanya ketika itu bekerja dan ketika tidak, tetapi juga merancang generasi editor dasar berikutnya untuk menjadikannya lebih baik dan lebih sesuai secara klinis."


Editor dasar adalah sejenis protein fusi Cas9 yang menggunakan Cas9 yang dinonaktifkan sebagian – gunting potongannya dinonaktifkan sehingga hanya memotong satu untai DNA – dan enzim yang, misalnya, mengaktifkan atau membungkam suatu gen, atau memodifikasi area DNA yang berdekatan. Karena penelitian baru ini melaporkan struktur pertama protein fusi Cas9, ini dapat membantu memandu penemuan berbagai alat pengeditan gen berbasis Cas9 lainnya.

"Kami benar-benar melihat untuk pertama kalinya bahwa editor dasar berperilaku sebagai dua modul independen: Anda memiliki modul Cas9 yang memberi Anda kekhususan, dan kemudian Anda memiliki modul katalitik yang memberi Anda aktivitas," kata Audrone Lapinaite, mantan UC Berkeley sesama postdoctoral yang sekarang menjadi asisten profesor di Arizona State University di Tempe. "Struktur yang kami dapatkan dari editor dasar ini terikat pada targetnya benar-benar memberi kami cara untuk berpikir tentang protein fusi Cas9, secara umum, memberi kami gagasan wilayah Cas9 mana yang lebih menguntungkan untuk menggabungkan protein lain."

Lapinaite dan Knott, yang baru-baru ini menerima posisi sebagai peneliti di Monash University di Australia, adalah penulis pendamping utama makalah ini.

Mengedit satu basis sekaligus

Pada 2012, para peneliti pertama kali menunjukkan cara merekayasa ulang enzim bakteri, Cas9, dan mengubahnya menjadi alat pengeditan gen di semua jenis sel, dari bakteri hingga manusia. Gagasan dari ahli biokimia UC Berkeley Jennifer Doudna dan rekannya dari Perancis, Emmanuelle Charpentier, CRISPR-Cas9 telah mengubah penelitian biologi dan membawa terapi gen ke klinik untuk pertama kalinya dalam beberapa dekade.

Para ilmuwan dengan cepat mengkooptasi Cas9 untuk menghasilkan banyak alat lainnya. Pada dasarnya adalah penghalusan protein dan RNA, Cas9 tepat menargetkan bentangan DNA tertentu dan kemudian memotongnya, seperti gunting. Fungsi gunting dapat dipatahkan, namun memungkinkan Cas9 untuk menargetkan dan mengikat DNA tanpa memotong. Dengan cara ini, Cas9 dapat mengangkut enzim yang berbeda ke daerah DNA yang ditargetkan, memungkinkan enzim untuk memanipulasi gen.

Pada tahun 2016, David Liu dari Universitas Harvard menggabungkan Cas9 dengan protein bakteri lain untuk memungkinkan penggantian tepat satu nukleotida dengan yang lain: editor basis pertama.


Sementara editor basis adenine awal lambat, versi terbaru, yang disebut ABE8e, sangat cepat: Ini menyelesaikan hampir 100% dari edit basis yang dimaksudkan dalam 15 menit. Namun, ABE8e mungkin lebih rentan untuk mengedit potongan-potongan DNA yang tidak diinginkan dalam tabung reaksi, berpotensi menciptakan apa yang dikenal sebagai efek diluar target.

Struktur yang baru terungkap diperoleh dengan teknik pencitraan bertenaga tinggi yang disebut cryo-electron microscopy (cryoEM). Uji aktivitas menunjukkan mengapa ABE8e cenderung membuat lebih banyak suntingan di luar target: Protein deaminase yang menyatu dengan Cas9 selalu aktif. Ketika Cas9 melompat di sekitar nukleus, ia mengikat dan melepaskan ratusan atau ribuan segmen DNA sebelum menemukan target yang dituju. Deaminase yang terpasang, seperti meriam longgar, tidak menunggu untuk pertandingan yang sempurna dan sering mengedit basis sebelum Cas9 datang untuk beristirahat pada target akhir.

Mengetahui bagaimana domain efektor dan Cas9 dihubungkan dapat menyebabkan desain ulang yang membuat enzim hanya aktif ketika Cas9 telah menemukan targetnya.

"Jika Anda benar-benar ingin merancang protein fusi yang benar-benar spesifik, Anda harus menemukan cara untuk membuat domain katalitik lebih menjadi bagian dari Cas9, sehingga akan terasa ketika Cas9 berada pada target yang benar dan hanya kemudian diaktifkan, alih-alih menjadi aktif sepanjang waktu, "kata Lapinaite.

Struktur ABE8e juga menunjukkan dua perubahan spesifik pada protein deaminase yang membuatnya bekerja lebih cepat daripada versi awal editor dasar, ABE7.10. Mutasi dua titik itu memungkinkan protein untuk mencengkeram DNA lebih erat dan lebih efisien mengganti A dengan G.

"Sebagai seorang ahli biologi struktural, saya benar-benar ingin melihat sebuah molekul dan memikirkan cara-cara untuk meningkatkannya secara rasional. Struktur ini dan biokimia yang menyertainya benar-benar memberi kita kekuatan itu," tambah Knott. "Kita sekarang dapat membuat prediksi rasional tentang bagaimana sistem ini akan berperilaku dalam sel, karena kita dapat melihatnya dan memprediksi bagaimana itu akan pecah atau memprediksi cara untuk membuatnya lebih baik."

You may also like...

Leave a Reply

This site uses Akismet to reduce spam. Learn how your comment data is processed.